細胞實驗技術及基本知識

一．細胞培養技術

細胞周期的測定

一、原理

    細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。

單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多采用其他方法測群體周期。

測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養基后，可做為細胞DNA復制的原料，經過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器、用品：同常規細胞培養

2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步驟

1、細胞生長至指數期時，向培養液中加入BrdU，使*終濃度為10μg/ml。

2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3、48小時后常規消化細胞至離心管中，注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

4、常規染色體制片（見第三部分：染色體技術）。

5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

6、棄去2×SSC液，流水沖洗。

7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

8、鏡檢100個分裂相，計**、二、三、四細胞期分裂指數。

9、計算： 細胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時）

附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml   4℃下避光保存。

  （2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉?2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。

細胞的凍存和復蘇

一、原理

   在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞*易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。

目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。

二、操作步驟

（一）凍存

1、消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。

2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。3、沉淀加含保護液的培養，計數，調整至5×106/ml左右。

4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。

5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現爆裂。

6、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。

7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態氮（30分鐘）→液氮。

注意：操作時應小心，以免液氮**。液氮定期檢查，隨時補充，**不能揮發干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）復蘇

1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內裝2/3杯37℃的溫水。

2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融化。

3、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。

4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。

5、沉淀加10ml培養液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。

6、加適當培養基后將細胞轉移至培養瓶中，37℃培養，**天觀察生長情況。

三、試劑和器材

器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機等

試劑：0.25％胰酶、培養基、含保護劑的培養基（即凍存液）

附：凍存液配制：

培養基加入甘油或DSMO，使其終濃度達5—20%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4℃下保存。

細胞系或細胞株的建立

一、概念

    1、細胞系（Cell Line）：原代培養舞經**傳代成功即成細胞系，由原先存在于原代培養物中的細胞世系（Lineage of Cells）所組成。

    2、細胞株（Cell Strain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養物或細胞系中獲得具有特殊性質或標志物稱為細胞株。細胞株的特殊性質或標志必須在整個培養期間始終存在。如果不能繼續傳代或傳代數有限，稱為有限細胞株（finitecell strain）；如果可以連續傳代，稱為連續細胞株（continuous cell strain）。對于人類腫瘤細胞，在體外培養半年以上，生長穩定，并連續傳代的即可稱為連續性株或系。

   二、建立細胞系（或株）的要求

   什么樣的體外培養群可被認可為己鑒定的細胞，視具體情況而定，無統一規定。對于用作原代培養的細胞只要供體均一，取材部位及組織種類等條件穩定即可，如用做長期培養，特別是反復傳代的細胞，常需做如下說明：

   1、組織來源：細胞供體所屬物種，來自人體或者動物；

                個體性別、年齡；取材的器官或組織。

                如系腫瘤組織，應說明臨床和病理診斷，以及病歷號等。

   2、細胞生物學檢測：

   了解細胞一般和特殊的生物學性狀，如細胞一般形態，特異結構，細胞生長曲線和分裂指數，倍增時間，接種率等。

   如為腫瘤細胞，為說明來源于原腫瘤組織并保持惡性，須做軟瓊脂培養，異體接種致瘤和對正常組織侵潤力等實驗。

   3、培養條件和方法；應說明細胞系（或株）適應的生存環境，即指明使用的培養基、血清種類、用量以及適宜PH值。

   三、若干細胞建株的要點及基本過程

   （一）腫瘤細胞培養技術要點

   1、取材：材料主要來源于外科手術或活檢瘤組織，取材時避免用壞死組織，要挑選瘤細胞集中和活力較好的部位，瘤性轉移**結或胸腹水是較好的培養材料。取材后盡快培養，因故不能立即培養者，可凍存。其培養方法及凍存方法同前述正常組織。

   2、成纖維細胞排除：在腫瘤組織中常混雜有一些成纖維細胞，培養時能與瘤細胞同時生長，并常壓過癌細胞，導致癌細胞生長受阻以至消失，應仔細排除。

   排除方法常有：機械刮除法、反復貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。

   3、提高腫瘤細胞培養存活率和生長率

   根據實驗經驗，腫瘤細胞在體外不易培養，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。一般當腫瘤組成或細胞被原代培養后，要經過對新環境的適應才能生長，因此不能局限于一般培養法，須采用一些特殊措施。如：用適宜底物，鼠尾膠原底層及飼細胞底層等。用細胞生長因子，根據細胞種類不同選用不同的促細胞生長因子，如胰島素、氫化可的松，雌**等。也可以考慮動物媒介培養。

  （二）人類**母細胞建株方法

   l、4ml肝素抗凝血于離心管中，加入2ml RPMI 1640。

   2、混勻后沿管壁緩慢加到預置有4ml**細胞分離液的液面上靜置30min。

   3、1500rpm，15min，吸取白細胞層（**層）于另一離心管中。

   4、加RPMI 1640 5ml洗滌白細胞兩次。

  5、將白細胞接種至1ml RPMI 1640培養基中，加入10μl環胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混勻。

   6、水浴搖床，40次/分，37℃，3hr。

  7、1500rpm，15min。將細胞接種至1ml培養基中（內含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl環胞霉素，輕輕混勻，37℃培養。

   8、5天后觀察細胞轉化和生長情況，決定是否半量換液。一般半量換液l—2次，并維持環胞霉素的濃度。

   9、待轉化細胞數量明顯上升，并出現細胞團塊后，可轉入25ml細胞培養瓶中，加1—2ml培養基，37℃培養10—15天，一般每隔3—4天觀察一次，決定是否換液，傳代。

   10、細胞生長達一定數量后凍存，凍存前應進行核型分析和存檔。

個別組織細胞的培養

體內組織細胞在體外培養時，所需培養環境基本相似，但由于物種、個體遺傳背景及所處發育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養技術措施亦不盡相同，現介紹個別組織細胞培養的要點如下:

一、上皮細胞培養

   上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養特別受到重視。但上皮細胞培養中常混雜有成纖維細胞，培養時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養關鍵。

   體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜，因此培養在有膠原的底物上可能利于生長，另外人或小鼠表皮細胞培養在以3T3細胞為飼養層（用射線照射后）時，細胞易生長并可發生一定程度的分化現象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長。

   以表皮細胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲得純上皮細胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）

   1、取材：外科植皮或手術殘余皮膚小塊，早產流產兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。

2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。

   3、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。

   4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。

   5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分鐘。

   6、反復吹打，制成懸液。

   7、培養：用80目不銹鋼紗網濾過后，低速離心，吸去上清。

   8、直接加入培養基（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養瓶，CO2溫箱培養。

   二、內皮細胞培養

內皮細胞易于從大血管分離培養成單層細胞，對于研究內皮****、腫瘤促血管生長因子（TAF）等有很大價值。

研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法*為簡便，其法如下：

1、產后新鮮臍帶，無菌剪取10—15厘米長一段，如不能立即培養，可于12小時內保存于4℃。

2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。

3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化3—10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

4、吸出含有內皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復）。5、離心去上清，加入RPMI1640培養液制成細胞懸液，接種入培養器皿中，置溫箱培養。兩至三天可見細胞長成單層。

三、神經膠質細胞培養

   神經細胞（神經元）不易培養，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經生長因子和膠質細胞因子時，可出現一定程度的分化，長出突起等現象，但很難使之增值。而神經膠質細胞是神經

組織中比較容易培養的成分。

人、鼠等腦組織即可用于神經膠質細胞培養，不僅能獲得生長的膠質細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來，膠質細胞在培養中生長不穩定，不易自發轉化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等誘發轉化。

養方法如下：

1、從手術室無菌取腦髓灰質或白質后，仔細剝除腦膜、血管和纖維成分，置Hanks液中漂洗一、二次。

2、置于30—50倍體積的Hanks液中，此時腦組織比較柔軟，反復吹打即制成細胞懸液。

3、把懸液注入離心管室溫中直立5—10分鐘后，細胞或細胞團快自然下沉，脂肪等雜物易漂浮，可吸除上層、反復二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎塊并獲較多細胞成分。

4、在沉降物中加入適量培養液，通過紗網成紗布過濾，計數并調整細胞密度。

5、接入培養瓶或皿中，置5%CO2溫箱中培養。

該細胞適應環境過程較長，接種后貼壁較慢。貼壁后短期內也可能不見細胞分裂現象，然而一旦生長后即能迅速進入旺盛的增殖狀態。細胞傳代可以0.25%胰酶消化處理。

四、肌組織培養

各種肌組織均可用于培養，以心肌和骨骼肌較實用。

（－）骨骼肌細胞培養

1、出生1一2天的乳鼠，引頸處死。

2、無菌取大腿肌組織，切成0.3一0.5cm2小塊后，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，無菌紗網或紗布濾過。

3、計數調整細胞密度。

4、快接種量2×106/皿入培養基培養。

5、培養基內含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促進分化。

  接種在膠原或膠原的底物上能促進細胞分化，明膠配置：用Hanks液配成0.01%明膠。

該細胞接種率約50%，細胞生長開始呈紡錘形，培養50－52小時后出現融合形成肌細胞狀多核纖維。數日后融合停止，此時可觀察到橫紋，一般在融合后二、三天內能見到收縮現象。

（二）心肌細胞培養

  心肌細胞是*早的培養材料，Carrel曾長期培養過心肌組織，至今心肌仍不失為好的培養物，*常用的是雞胚心肌。

  心肌比較容易培養和生長，可用懸滴培養、組織塊培養和消化培養法，均可獲良好的效果。取心室肌培養較好，原代培養的雞胚心肌呈紡錘形，培養成功時，一周后可見節律性收縮現象。

五、巨噬細胞培養

巨噬細胞屬**細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞**和分子**學的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養，難以長期生存。

巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養中呈巨噬細胞形態和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。

  培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法*為實用，其法如下：

1、實驗前三天，向小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內！），以刺流產生大量的巨噬細胞。

2、引頸處死小鼠。

3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。

4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側，暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時用手指從兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內流動。

6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內。

7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。

8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10ml Eagle培養基。

9、計數細胞。每只鼠可產生20一30×106細胞，其中90%為巨噬細胞。

10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種。

11、接種數小時后，除去培養液，可去除其它白細胞，純化培養細胞，用Eagle液沖洗1一2次，再加新Eagle培養液置CO2溫箱中。

六、腎小球分離、移植培養

SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡1～2分鐘，2次，置超凈臺內，打開腹腔取出腎臟剪碎，置含Hank’s液的無菌培養皿洗滌，置80目不銹鋼篩網上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產物微小組織透過篩網，濾過組織Hank’s液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網，濾過，去小組織塊，濾過物吸至200目不銹鋼篩網，輕輕濾過，Hank’s液洗滌1次，收集網上腎小球，鏡下觀察為分離良好的腎小球。腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37℃消化20分鐘，加血清終止胰酶反應，離心除去膠原酶。處理過的腎小球計數后接種至24孔培養板或25ml培養瓶，使腎小球大于60個/cm2，加培養基5～10ml（培養基組成：F12—3T3上清1：1；5%馬血清；2.5%胎牛血清；胰島素5μg/ml；25ng/ml氫化可的松；5μg/ml轉鐵蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲狀腺素0.02ng/ml；D-纈氨酸150ng/ml）腎小球培養8～10天，去除腎小球未生長組分，細胞繼續培養24小時，形態學觀察：細胞生長成單層多角型細胞，直徑約100μm。

七、裸小鼠移植瘤單細胞分離培養

無菌條件下取出小鼠移植瘤組織，剪成1mm3小塊，用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時，再加等體積0.2%胰酶消化5～8分鐘，在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置（分別作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接而成，濾器中間墊兩層絲質材料以隔斷組織塊與單細胞）來回推動注射器吹打組織以分離單細胞，終止酶消化方法同上。常規方法接種培養收獲細胞。

二．細胞培養的基本內容

常用設備

準備室的設備：

單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未**物品）、儲品柜（放置**過的物品）、包裝臺。

配液室的設備：

扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計（測量培養用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。

培養室的設備：

液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統、低溫冰箱（-80℃）、空調、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。必須放在無菌間的設備：離心機（收集細胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養物）、水浴鍋、三氧****機、4℃冰箱（放置serum和培養用液）。

無菌操作

無菌室的**：

1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5％過氧乙酸擦拭。

2.CO2孵箱（培養箱）**：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過氧乙酸，再用紫外燈照射

3.實驗前**：打開紫外燈、三氧**機、空氣凈化器系統各20-30分鐘

4.實驗后**：用75％酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。

實驗人員的無菌準備：

1.肥皂洗手。

2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋

3.用75％酒精棉球擦凈雙手。

無菌操作的演示：  

1.凡是帶入超凈工作臺內的酒精、PBS、培養基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面

2.靠近酒精燈火焰操作。

3.器皿使用前必須過火**

4.繼續使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。

5.各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。

6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。

器械的清洗和**

玻璃器械洗消：

一、新的玻璃器皿的洗消：

1.自來水刷洗，除去灰塵。

2.烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。

3.刷洗、烘干：12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時，然后從酸缸內撈出器皿用自來水沖洗15次，*后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過3次。

5.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。

6.高壓**：包裝好的器皿裝入高壓鍋內蓋好蓋子，打開開關和**閥，當蒸氣成直線上升時，關閉**閥，當指針指向15磅時，維持20-30分鐘。

7.高壓**后烘干

二、舊的玻璃器皿的洗消：

1．刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。

2.泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時后從酸缸內撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。

3.烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于**儲存及防止灰塵和再次被污染。

4.高壓**：包裝好的器皿裝入高壓鍋內，蓋好蓋子，打開開關和**閥，隨著溫度的上升**閥冒出蒸氣，當蒸氣成直線冒出3-5分鐘后，關閉**閥，氣壓表指數隨之上升，當指針指向15磅時，調節電開關維持20-30分鐘即可。（玻璃培養瓶**前可將膠帽輕輕蓋上）

5.烘干備用：因為高壓**后器皿會被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內烘干備用。

金屬器械洗消：

  金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75％酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內包裝好在高壓鍋內15磅高壓（30分鐘）**，再烘干備用。

橡膠和塑料：

橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據不同品質進行如下的處理程序：

1 . 針式濾器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小時,或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內15磅30分鐘**，再烘干備用。注意在超凈臺內取出使用時應該立即將螺旋旋緊。

2. 膠塞烘干后用2％氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。*后裝入鋁盒內高壓**，烘干備用。

3. 膠帽，離心管帽烘干后只能在2％氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時（切記時間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。*后裝入鋁盒內高壓**，烘干備用。

4. 膠頭可用75％酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。

5.塑料培養瓶，培養板，凍存管：

6.其他**方法：有的物品既不能干燥**，又不能蒸氣**，可用70％酒精浸泡**。塑料培養皿打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下**。也可用氧化乙烯**塑料制品，**后需要用2—3周時間洗除殘留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射線**塑料制品效果*好。

為了防止清洗器材已**與末**發生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號，平時這種墨水不帶痕跡，一經高溫，即出現字跡，從而可以判定它們是否**。密寫墨水的配制：氯化鉆(CoC12?6H2o)2g，30％鹽酸10m1，蒸餾水88m1。

注意事項：

1.嚴格執行高壓鍋的操作規程：高壓**時，先檢查鍋內是否有蒸餾水，以防高壓時燒干，水不能過多因為其將使空氣流暢受阻，會降低高壓**效果。檢查**閥是否通暢，以防高壓時爆炸。

2.安裝濾膜時注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。

3.注意人體的防護和器皿的完全浸泡：A.泡酸時要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內撈取器皿時防止酸液濺到地面，會腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。

細胞培養用液的配制與**

器材與試劑：

干粉型培養基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統、電子天平、PH計、磁力攪拌器。

具體步驟：

一. 水的制備：

細胞培養用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水

二.PBS的制備與**(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：

1.溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4?H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。

2.移入溶液瓶內待**：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內8磅**20分鐘。注意高壓**后要用**蒸餾水補充蒸發掉的水份。

三. 胰蛋白酶溶液的配制與**：

  胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關，在pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力*強。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。

1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內過夜。

2.用注射濾器抽濾**：配好的胰酶溶液要在超凈臺內用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾**。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。

四.青、鏈霉素溶液的配制于**

1.     所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘**。

2.具體操作均在超凈臺內完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml**雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml**雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。

3.使用時溶入培養液中，使青鏈霉素的濃度*終為100單位/ml。1單位＝1微克？

五.RPMI1640的制備與**：

1.溶解、調PH值、定容：先將培養基粉劑加入培養液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養基中),充分攪拌至粉劑全部溶解,并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度*終各為100單位/ml。然后用一個當量的鹽酸和NaOH調PH到7.2左右。*后定容至1000ml，搖勻。

2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待**。

3.抽濾：配制好的培養液通常用濾器過濾**。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內過濾。

4.分裝：將過濾好的培養液分裝入小瓶內置于4℃冰箱內待用。

5.使用前要向100ml培養液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時兩周有效）。

六．血清的滅火：

細胞培養常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后，再經過抽濾方可加入培養基中使用。

七.HEPES溶液：

HEPES的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養液內含20mmol/LHEPES即可達到緩沖能力。

1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：

準確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾**，分裝后4℃保存。

注意：因為現在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據實際情況靈活配制，但是要保證培養液內HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾**后可完全（20ml）加入1L培養液中，或者每100ml培養液中加入2ml即可。

八.谷氨酰胺：

合成培養基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長**甚至死亡。在配制各種培養液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定，4℃下放置1周可分解50％，故應單獨配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養液。加有谷氨酰胺的培養液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的谷氨酰胺。

一般培養液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾**，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

九.肝素溶液的配制：

含有肝素的培養液可以使內皮細胞純度提高，肝素加入全培養液中*終濃度為50ug/ml。因為現在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾**，分裝小瓶，保存溫度為?? ℃ 。使用時，向100ml培養液中加入1ml（**可加入0.9ml）即可。

十. Ⅰ型膠原酶：

0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和****。注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾**。分裝入10ml小瓶-20℃保存。

十一.明膠溶液：

因為明膠難于過濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中，4℃保存。

其他培養用液的配制：

20ug/ml內皮生長因子，

注意事項：

1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。

2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米 和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。

3.配制RPMI1640培養基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養液PH值*終為7.2，可在配制時調PH至7.4。

細胞傳代培養（消化法）

具體操作：

一. 傳代前準備：

1.預熱培養用液：把已經配制好的裝有培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。

2.用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。

3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。

4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。

  5.準備好將要使用的**后的空培養瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次**。

6.取出預熱好的培養用液：取出已經預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。

  7.從培養箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。

  8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口**。

二.胰蛋白酶消化；

  1.加入消化液：小心吸出舊培養液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞*好，*佳消化溫度是37℃。

  2. 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。

  3.吸棄消化液加入培養液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養液。

三.吹打分散細胞：

1.吹打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。

2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。

3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉/分鐘離心6-8分鐘。

   4.棄上清液，加入新培養液：棄去上清液，加入2ml培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

四.分裝稀釋細胞：

   1.分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。

   2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml。*后要做好標記。

五.繼續培養：

   用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養瓶底面積25％時為一個＋，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋。

傳代細胞培養注意事項：

  1.嚴格的無菌操作

   2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：

EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓**，使用時調節PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養瓶要徹底清洗，否則再培養時細胞容易脫壁。

細胞的復蘇

細胞復蘇的原則－快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

具體操作

一. 實驗前準備：

1.將水浴鍋預熱至37℃

2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

  3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等等。

二．取出凍存管：

  1.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。

  2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。

三．迅速解凍：

  1.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

  2.約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。

四.平衡離心：

   用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3min

五.制備細胞懸液：

   1.吸棄上清液。

   2.向離心管內加入10ml培養液，吹打制成細胞懸液。

六.細胞計數：

  細胞濃度以5×105/ml為宜。

七.培養細胞

  將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃和5％CO2的培養箱內2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續培養培養，換液的時間由細胞情況而定。

初學者易犯錯誤：

1水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。

2.水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。

3.離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。

4.一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。

細胞計數

實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。

具體操作：

一.準備工作：    

   取一瓶傳代的細胞，按照《傳代細胞培養（消化法）》中的傳代方法繁殖細胞，待長成單層后以被使用。

二.細胞懸液制備：

細胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細胞懸液。

三.細胞計數：

1.蓋好蓋玻片：取一套血球計數板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上。

  2.制備計數用的細胞懸液：用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍染液（0.4％）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞。

  3.將細胞懸液滴入計數板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

  4.統計四個大格的細胞數：將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，當看到鏡中出現計數方格后，數出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數目。

  5.計算原細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度：

（細胞懸液的細胞數）/ml＝          （ 四個大格子細胞數/4)         ×2×104

說明：公式中除以4因為計數了4個大格的細胞數。

公式中乘以2因為細胞懸液于染液是1：1稀釋。

公式中乘以104因為計數板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3

四.細胞計數要點：

  1.進行細胞計數時，要求懸液中細胞數目不低于104個/ml，如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養液中；

  2.要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。

  3.取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確；

  4. 數細胞的原則是只數完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。

  5. 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。

五.初學者易犯的錯誤：

  1. 計數前未將待測懸液吹打均勻。

  2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。

  3. 滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

六.本實驗特殊試劑的配制：

4％臺盼藍母液：稱取4克臺盼藍，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。

使用液：使用時，用PBS稀釋母液至0.4％即可。

細胞的凍存

1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。

2.接著置于-20℃冰箱，約30-60min。

3.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。

4.置于液氮罐中長期保存。

5同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項：

1.使用DMSO前，不需要進行高壓**，它本身就有**的作用。高壓**反而會破華它的分子結構，以至于降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時*好戴上手套操作。

2.不宜將凍存細胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內過久，低溫損傷主要發生在這一溫度區內，是“危險溫區”。

3.注意定期檢查液氮罐內液氮量，及時添加。