細胞培養相關問題及解答

小牛血清和胎牛血清有何區別？應用注意事項？

來源不同：胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰懷孕母牛的時候,通過心臟穿刺采血獲取的胎牛的血清，新生牛（小牛）血清（Calf serum, CS）采自出生10至14 天的小牛。

組份與比例不同：兩者所含的促細胞生長因子、促貼附因子、**及其他活性物質等組份與比例不同，用途與用法不同：某些細胞必需胎牛血清才能生長，而有些細胞只需小牛血清即可，使用濃度不同，一般在5%-10%，有特殊要求的濃度在20%。

血清保存和使用須注意：血清應保存在-5℃至-20℃，若存放在4℃不可超過一個月。解凍血清時，應先將血清至于2-8℃冰箱，并經常搖勻使之溶解，然后至室溫放置使之升溫，**不可將冷凍的血清直接放入37℃水浴或者溫箱中，如放在37℃解凍，顏色加深，粘稠度也會增加，血清在解凍和熱滅活后，應按用量分裝并于-20℃保存，避免反復凍融。

胰酶消化傳代的濃度是多少？是否含EDTA？濃度？

胰酶消化傳代的一般濃度為0.25%，部分細胞由于貼壁較緊，需要加0.53mM 的EDTA，如果做原代培養，胰酶的濃度需要做適當的提高。

常用細胞株推薦的培養基及特殊要求？

常規培養基的選用一般原則，懸浮培養細胞以RPMI1640為主、貼壁培養的細胞以DMEM為主，部分細胞需用特殊培養液來培養，如Mccoy’5A、L-15、F12K、D+F12 等等。

細胞株的污染鑒定、預防和處理問題。

普通微生物污染：培養基渾濁，高倍鏡觀察有微生物污染；按規定棄用并**嚴格**。

支原體污染：顯微鏡無法觀察，依經驗表現為細胞生長緩慢，有細胞漂浮等等，應通過pcr 等方法鑒定，如發現支原體污染，應按規定棄用，實驗室要及時******，防止蔓延。（有些常規性細胞學實驗不受支原體污染影響，可以繼續使用細胞傳代，為防污染擴大蔓延，可以選擇性的在培養基中加入高效價的其它種***，并在隔離實驗室操作和獨立使用一切用具與培養基等）。

如何傳代貼壁細胞？

細胞在培養瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續生長，同時也將細胞數量擴大，就必須進行傳代（再培養）。傳代培養也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。

懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。一般使用蛋白水解酶（比如胰蛋白酶）消化貼壁細胞成單個細胞，也可加入乙二胺四乙酸（EDTA）提高消化能力，EDTA 是一種二價離子的螯合劑，能抑制細胞膜上的Ca2+和Mg2+。常用的細胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA，一般用不含Ca2+和Mg2+的鹽溶液配置，先用胰酶-EDTA 消化液清洗細胞（5.0 -10.0 ml/75cm），然后棄去消化液，重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(2.0 to 5.0 ml/75 sq. cm flask)，觀察細胞直到細胞變圓脫離瓶壁，此過程一般需要5-15分鐘，為了避免細胞成團，消化細胞的過程中不要拍打細胞瓶。對于特別難消化的細胞，可以加入胰酶EDTA 消化液后把細胞置于37°C 促進消化，細胞脫離瓶壁后，立刻加入含有血清的完全培養基中止消化，血清中某些蛋白質能夠抑制胰酶的活性。

一般情況下，離心并不需要。如果細胞需要無血清或者低血清的培養基，可以以125000g 轉速離心5分鐘，然后棄去中止用的培養基，加入適合的新的培養基輕輕混勻細胞，移入到新的培養瓶。傳代的比例視細胞類型而定，一般是1:2-1:20，具體比例可參考說明書。胰蛋白酶會對某些細胞的細胞膜產生損傷，對于這種類型的細胞，可用細胞刮輕輕刮下細胞，加入適量的培養基，輕輕吹打混勻細胞，然后進行傳代培養。

傳代細胞的頻率多久較合適？

傳代是指把細胞從一個培養瓶移到另一個培養瓶，傳代的間隔是指兩次傳代之間的時間。

貼壁型的細胞的匯合度達到或者接近100%的時候，需進行傳代操作，但是，有些細胞以克隆的形式生長，匯合度永遠達不到100%，對于這種類型的細胞，細胞達到或者接近*大密度的時候，就需傳代。接觸抑制型細胞（比如3T3）需要在細胞長滿之前傳代以避免產生細胞長滿后接觸抑制后產生性狀的改變。懸浮型的細胞必須在細胞達到*大飽和密度之前傳代，懸浮細胞傳代時只需稀釋至合適的密度，讓細胞有充足的營養恢復到對數生長期。

如果僅僅是簡單的換液，而且細胞數量不減少，細胞將會快速耗盡營養而死亡；如果細胞稀釋到*低密度之下，細胞將會進入停滯期而不增殖或者死亡。不同的懸浮細胞的*大飽和密度和傳代的間隔與比例是不同的，所以，培養懸浮細胞要每日觀察。

如何處理對于生物**性不清楚地腫瘤細胞株？

了解每株細胞可能產生的生物危害是很難的，但是強烈推薦，所有的人類和其他靈長類生物的細胞在能否預防HIV和肝炎病毒的實驗條件下操作，所有的操作必須在垂直層流超凈臺內操作（推薦生物**柜），操作過程中產生的廢液和廢儀器都要經過清洗、酸處理等處理后才能丟棄。

能否使用細胞說明書上不同的培養基來培養細胞？

產品目錄或者細胞說明書上的推薦的培養基一般是細胞株的原始提供者推薦的培養基或者已經經過驗證的對該細胞株*合適的培養基，細胞對未推薦的培養基也許會適應，也有可能不適應。對于更換培養基，應謹慎對待，更換培養基時，應留一瓶細胞使用推薦的培養基培養，留作種子。

更換培養基有兩種方法，*簡單的方法是直接更換培養基，強制使細胞適應新的培養基；還有一種更溫和的方法：傳代細胞的時候分成細胞兩瓶，**瓶使用原來推薦的培養基，**瓶使用50%原來推薦的培養基，50%新的培養基，之后仔細觀察細胞的生長狀態，如果**瓶細胞生長狀態不好，應立即停止更換培養基，如果**瓶生長狀態好，可以繼續傳代分瓶，一瓶使用50%原來推薦的培養基，50%新的培養基，另一瓶使用25%原來推薦的培養基，75%新的培養基，繼續觀察，如果細胞狀態好，可以全部換成新鮮的培養基。